人工瘤胃技術評定飼料營養(yǎng)價值研究進展

飼料營養(yǎng)價值的正確評定是開展動物營養(yǎng)學研究和指導實際生產(chǎn)的基礎，主要包括兩大部分，一是飼料營養(yǎng)成分的測定，二是各營養(yǎng)成分可利用率評定。在飼料營養(yǎng)成分測定上，雖然康奈爾凈碳水化合物和蛋白質(zhì)體系（Cornell NetCarbohydrate and Protein System，CNCPS）打破傳統(tǒng)瘤胃“黑箱”，把飼料養(yǎng)分和瘤胃發(fā)酵直接聯(lián)系起來，但由于檢測手段較為繁瑣且缺乏大量數(shù)據(jù)支持檢測結果與體內(nèi)利用率的直接關系，目前尚未在我國推廣開來，國內(nèi)現(xiàn)在絕大多數(shù)營養(yǎng)學實驗室和生產(chǎn)企業(yè)仍然沿用Hennebery和Stohmann于1862年在Weende實驗站提出的概略養(yǎng)分分析結合Van Soest提出的纖維分析法對飼料營養(yǎng)成分進行測定。在營養(yǎng)成分可利用率的評定上，常用方法包括體內(nèi)法，尼龍袋法（半體內(nèi)法）和人工瘤胃技術（體外法），近年來由于人工瘤胃技術的發(fā)展與自身具有的優(yōu)勢，現(xiàn)已逐漸成為應用最為廣泛的方法。以下對國內(nèi)外目前用于評定飼料營養(yǎng)價值的人工瘤胃技術作一綜述。

反芻動物瘤胃是一個動態(tài)發(fā)酵罐，飼料、唾液和水不斷流入瘤胃，飼料營養(yǎng)成分在瘤胃中被微生物發(fā)酵、轉化，同時發(fā)酵產(chǎn)物被瘤胃上皮吸收或從瘤胃中流出，進入后部消化道。根據(jù)瘤胃發(fā)酵的特點，使用儀器設備在體外模擬瘤胃的發(fā)酵條件，這樣的模擬裝置稱之為人工瘤胃或瘤胃模擬技術（rumensimulation technique，RUSITEC）。

早期的人工瘤胃技術主要應用于較簡單的研究目的，這一時期的發(fā)酵裝置也比較簡單，不少裝置僅是在厭氧的條件下對瘤胃液進行了簡單的培養(yǎng)。20世紀50~60年代，人工瘤胃技術在牧草有機物和纖維素瘤胃降解研究方面得到了大量應用，這一階段的人工瘤胃裝置趨于復雜，更接近瘤胃發(fā)酵的真實情況。至20世紀70年代，隨著蛋白質(zhì)營養(yǎng)研究的深入，人工瘤胃技術開始應用于飼料蛋白質(zhì)的瘤胃降解率評定。80年代后期，人工瘤胃技術的應用范圍擴展到研究營養(yǎng)物質(zhì)對瘤胃微生物合成量的影響及營養(yǎng)物質(zhì)的匹配關系，這一時期發(fā)展的人工瘤胃裝置以可控性持續(xù)動態(tài)發(fā)酵的模擬裝置為主，我國代表的裝置有中國農(nóng)業(yè)大學自行研制的RSI~II型瘤胃持續(xù)動態(tài)模擬裝置。

至今，人工瘤胃技術發(fā)展比較成熟，應用十分廣泛，涉及營養(yǎng)學、微生物學、環(huán)境科學等多個學科領域。人工瘤胃的類型也很多，根據(jù)研究目的總體上可分為短期發(fā)酵人工瘤胃和長期發(fā)酵人工瘤胃兩大類。就評定飼料營養(yǎng)價值方面，短期發(fā)酵人工瘤胃的應用更為廣泛。

短期發(fā)酵人工瘤胃裝置的共同特點是靜態(tài)發(fā)酵，不對產(chǎn)物和底物進行分離，因此只能持續(xù)較短的時間。但試驗裝置簡單、容易標準化、重復性好，在飼料營養(yǎng)價值評定等研究方面具有很大的價值。

反芻動物的消化過程主要包括兩個步驟：第一步是瘤胃消化，在瘤胃微生物的作用下進行；第二步是真胃消化，主要在胃蛋白酶的作用下進行。Tilley和Terry就是在此基礎上建立了兩步法（兩階段培養(yǎng)法），首先使用離心管培養(yǎng)瘤胃液和飼料樣品培養(yǎng)48小時，再使用胃蛋白酶消化48小時，消化結束后分離殘渣進行分析。與其他技術不同的是，該方法不僅模擬了瘤胃消化，而且同時模擬了真胃及部分小腸的消化過程，在所有體外法中最具有代表性，自建立以來在歐美國家應用廣泛，是評定反芻動物飼料消化率的最常見方法。

Monson等報道了體內(nèi)尼龍袋法與兩步法在檢測一些粗飼料時表現(xiàn)的高度相關性（R=0.81）。Van Soest認為Tilley和Terry最初的兩步法步驟繁瑣，試驗周期過長，可能對試驗重復性有影響。因此，不少學者先后對兩步法做了改進，縮短了試驗周期，簡化了試驗步驟。在國內(nèi)，不少研究人員先后采用兩步法測定干物質(zhì)、有機物及蛋白質(zhì)的瘤胃降解率，均取得較好效果。

兩步法在評定飼料蛋白質(zhì)可消化性上具有明顯優(yōu)勢，尤其是對于過瘤胃可利用蛋白含量較高的飼料，如DDGS，酒糟等發(fā)酵飼料，這類飼料蛋白不易被瘤胃微生物利用，但能被機體很好的吸收，若只使用尼龍帶法或其他體外法則不能客觀地評價其營養(yǎng)價值。此外，雖然兩步法克服了常規(guī)試驗方法的許多限制因素，但不能反應飼料的動態(tài)降解信息，在一定程度上不利于飼料的篩選，加上短期發(fā)酵人工瘤胃技術不能外排發(fā)酵終產(chǎn)物的特點，可能會影響測定的準確性，這要求兩步法需要有好的重復性并且使用體內(nèi)法獲得的數(shù)據(jù)進行校正。

酶解法指的是使用酶溶液對飼料營養(yǎng)價值進行評定的一種體外方法，與兩步法最大的不同在于不使用瘤胃液，從而從根本上擺脫了對瘺管動物的依賴。多使用商業(yè)生物酶制劑（蛋白酶、纖維素酶等）與飼料樣品混合培養(yǎng)以評定有機物或蛋白質(zhì)降解率，目前主要有單一胃蛋白酶解法、單一纖維素酶解法和纖維素酶—蛋白酶復合酶解法。

在Tilley和Terry建立兩步法之后，有學者使用纖維素酶替代變異較大的瘤胃液對其進行改進，取得了很好的效果。Krishnamoorthy等采用牛鏈球菌中提取的蛋白酶作為測定蛋白消化率的酶類測得不溶性氮與體內(nèi)法測得的結果之間存在一定的相關性（R=0.78）。在酶制劑的選擇上，一些學者認為，如果不使用來自瘤胃的胃蛋白酶，其對飼料蛋白的活性可能有較大差異，從而導致結果偏差較大。我國顏品勛等使用胃蛋白酶測定多種飼料蛋白降解規(guī)律，以尼龍袋法做對照，取得較好的效果，從試驗結果可以看出，若將粗飼料進一步分類，可進一步提高酶解法與尼龍帶法的相關性。

酶解法優(yōu)點在于易于標準化，穩(wěn)定性高，實驗室間可比性強，能大批量操作，成本低，不必維持實驗動物。但酶解法更適用于比較不同飼料之間的相對差異而不是用于評定體內(nèi)消化率，其對能量含量高的飼料可能優(yōu)于尼龍袋法，但對粗飼料測定的重復性較差。

利用人工唾液稀釋的新鮮牛糞或羊糞作為菌源替代瘤胃液測定飼料營養(yǎng)成分體外消化率的方法稱為糞液法。反芻動物的大腸內(nèi)容物和排泄物中含有許多瘤胃微生物，如瘤胃乳酸桿菌、瘤胃球菌、牛鏈球菌、反芻真細菌和梭桿菌等，這些微生物在一定程度上逃避了消化酶的作用而存活下來，并以大腸內(nèi)的食物殘渣作為發(fā)酵底物生長和繁殖。這些存在于糞便中的活性瘤胃微生物構成了糞液對飼料消化能力的基礎。

Balfe觀察到羊糞液可以消化濾紙后，在她的畢業(yè)課題中使用糞液替代兩步法中的瘤胃液測定了四種牧草的消化率，發(fā)現(xiàn)其結果與體內(nèi)法結果之間存在高度相關性（R=0.93）。Puw采用馬和牛的糞便作為菌源替代兩步法中的瘤胃液同樣證明了牛糞液對飼草具有消化能力。我國20世紀90年代以來，也有不少學者對糞液法做了相關的研究，苗志虹等采用羊糞替代兩步法中的瘤胃液測定了不同飼草的干物質(zhì)消化率，并對測定時的最適稱樣量和糞液加入量做了研究。張永根等采用糞液法和尼龍袋法對29種牧草做了有機物與蛋白質(zhì)降解率的比較研究，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在極顯著的相關關系（P＜0.01）。

盡管飼料品種對糞液細菌活性有一定的影響，但這種影響要遠小于對瘤胃液的影響，這可能與糞液中微生物的組分和活性有一定的關系?？傮w上來說，糞液法具有簡單、重復性好、適合大批量測定等優(yōu)點，和酶解法相同，糞液法更適合不同飼料間消化率差異的比較，在養(yǎng)殖現(xiàn)場或放牧條件下批量檢測粗飼料消化率比較有潛力。但目前不同學者使用的糞液法有所差異，并且有學者認為糞液法并不適合測定秸稈類低質(zhì)粗飼料，因此在適用范圍和標準化上有待進一步研究。

溶解度法是指通過測定飼料營養(yǎng)成分（主要是蛋白和碳水化合物）在緩沖液中的溶解度來評定飼料消化率的方法。

測定可溶性氮的常用緩沖液包括，熱蒸餾水、硼酸—磷酸鹽溶液，70%乙醇、氯化鈉溶液、McDougal人工唾液、Burrough緩沖液和熱壓處理瘤胃液。測定可溶性碳水化合物所常用的方法有，首先使用熱水提取或酸水解提取可溶性碳水化合物，再通過與鐵氰化物反應定量。

溶解度法不能將飼料的緩沖液溶解度與瘤胃消化率有效結合起來，其檢測結果受到飼料自身蛋白和碳水化合物組成、溶劑化學組成、離子濃度、pH值等多方面影響，應用受到限制。除法國飼料蛋白評估體系采用溶解度法估測常用飼料蛋白的降解程度外，溶解度法在其他地區(qū)使用較少。

體外產(chǎn)氣法是用于評定反芻動物飼料營養(yǎng)價值非常有效的方法，通過飼料樣品在體外用瘤胃液發(fā)酵所產(chǎn)生氣體(CO₂和CH₄)的速率和含量來估計飼料營養(yǎng)價值，可以評定飼料的有機物和干物質(zhì)降解率、估測代謝能、監(jiān)測飼料的動態(tài)降解特性及飼料間的組合效應。

早在1884年，瘤胃發(fā)酵與產(chǎn)氣量之間的關系就被人們所認識到，但瘤胃發(fā)酵氣體測量技術從上世紀40年代才逐漸開始出現(xiàn)。直到德國霍恩海姆大學動物營養(yǎng)研究所Menke等發(fā)現(xiàn)體外發(fā)酵產(chǎn)氣量與體內(nèi)表觀消化率之間呈高度相關后，體外產(chǎn)氣法才得到動物營養(yǎng)學家的重視，此后廣泛應用于飼料營養(yǎng)價值評定。

產(chǎn)氣法的發(fā)展與產(chǎn)氣設備密切相關。最初的產(chǎn)氣記錄設備十分簡單，多采用針口密封的有刻度的注射器，通過產(chǎn)氣推動活塞來觀察產(chǎn)氣量。隨后壓力傳感裝置被應用到產(chǎn)氣量測定上，Pell和Schofield借助壓力傳感器測定產(chǎn)氣瓶的壓力，再通過軟件轉換成大氣壓下的產(chǎn)氣量，取得了很好的效果。之后，手動型產(chǎn)氣定點測定裝置，半自動產(chǎn)氣定點實時記錄系統(tǒng)和全自動發(fā)酵產(chǎn)氣實時記錄裝置相繼出現(xiàn)，體外產(chǎn)氣法在營養(yǎng)學研究上得到廣泛應用。我國20世紀90年代以來，在體外產(chǎn)氣法研究和應用上進行了大量實踐，取得了一定的成果，其中最具有代表性的是中國農(nóng)業(yè)大學反芻動物營養(yǎng)研究室自助研發(fā)的AGRS型微生物體外發(fā)酵產(chǎn)氣實時記錄系統(tǒng)（國家發(fā)明專利授權號：ZL200610011301.X）。

目前，體外產(chǎn)氣法不僅用于飼料的營養(yǎng)價值評定，在評價飼料組合效應，預測動物采食量，測定甲烷排放量和研究人及其他單胃動物營養(yǎng)中均有廣泛應用。更有學者將體外產(chǎn)氣法與高通量等分子生物學技術結合起來開展瘤胃微生物菌群結構變化等機理研究。不過，雖然體外產(chǎn)氣法能較真實地模擬瘤胃環(huán)境、操作簡便、重復性好，具有很高的應用價值，但其本身仍屬于短期發(fā)酵人工瘤胃，內(nèi)容物不能外移，發(fā)酵終產(chǎn)物積累會使得瘤胃微生物生存環(huán)境發(fā)生變化，從而在一定程度上對結果的準確性造成影響。此外，在使用產(chǎn)氣法評定飼料營養(yǎng)價值時值得注意，因為體外產(chǎn)氣量與飼料碳水化合物的消化高度相關，而與飼料蛋白的關系并不密切，所以不能單純地使用產(chǎn)氣量來衡量飼料的營養(yǎng)價值，尤其是對于蛋白含量高的飼料，需要將產(chǎn)氣量與干物質(zhì)消失率、揮發(fā)性脂肪酸和微生物蛋白產(chǎn)量結合起來，才能準確全面地評估飼料的營養(yǎng)價值。

長期發(fā)酵人工瘤胃的結構比較復雜，能最大限度地模仿瘤胃的特點，可用于常規(guī)飼料營養(yǎng)價值評定、蛋白質(zhì)飼料瘤胃保護技術、各種化學試劑和藥物對微生物代謝的影響及瘤胃營養(yǎng)調(diào)控等方面的研究。長期發(fā)酵人工瘤胃與短期發(fā)酵人工瘤胃最大的不同在于，發(fā)酵基質(zhì)和人工唾液不斷流入發(fā)酵容器，發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵液也不斷流出，使人工瘤胃發(fā)酵處于動態(tài)平衡中，培養(yǎng)時間可長達數(shù)周或數(shù)月。

從Czerkawski等提出長期發(fā)酵人工瘤胃技術并設計了長期發(fā)酵人工瘤胃至今，較為成功的長期發(fā)酵人工瘤胃有Czerkawski和Breckenridge建立的Rusitec裝置，Hoover研制的CC裝置，我國相繼研發(fā)的瘤胃持續(xù)模擬裝置（RSI）和雙外流連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)（CCS）。最初的人工瘤胃是單外流系統(tǒng)，即食糜固相和液相均以相同速度外流。Slyter和Putnam認為，與真實瘤胃內(nèi)環(huán)境相比，在飼喂相同日糧的條件下這種人工瘤胃的原蟲數(shù)目偏低，細菌數(shù)量偏高。在上述四種人工瘤胃中，除Rusitec裝置外，其余三種都是雙外流系統(tǒng)，即對食糜固相和液相外流速度分別加以控制。雙外流系統(tǒng)更接近瘤胃發(fā)酵的真實情況。

長期發(fā)酵人工瘤胃具有短期發(fā)酵人工瘤胃不可比擬的優(yōu)越性，將長期發(fā)酵人工瘤胃單純用于飼料營養(yǎng)價值評定的研究比較少見，多用于研究反芻動物瘤胃生理學、發(fā)酵生物化學等機理研究，也用于部分特殊飼料的評價。近年來，國內(nèi)外使用長期發(fā)酵人工瘤胃開展的研究多集中在不同礦物質(zhì)、非蛋白氮及其他非常規(guī)添加劑對瘤胃發(fā)酵的影響。