酵母水解物中小肽的測定方法及意義

　　酵母中含有三類大分子：蛋白質(zhì)、核酸和多糖，其中蛋白質(zhì)幾乎占了干物質(zhì)一半以上的含量，必需氨基酸充足，呈味氨基酸豐富，總谷氨酸含量在6%以上，色氨酸在1%以上，所以酵母水解物誘食性絕佳。

　　新鮮酵母中的蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的肽類物質(zhì)，曾引起專家和配方師們的廣泛關注與討論，那么酵母水解物中的小肽具體含量應該是多少?是否可以精確、重復檢測?以下內(nèi)容是由湖北海宜為大家整理的小肽的定義及檢測方法：

　　一、什么是小肽?

　　肽是蛋白質(zhì)降解為游離氨基酸過程中的中間產(chǎn)物，通常將大于20個的氨基酸殘基構(gòu)成的肽稱為多肽(Poly-peptide)，2-20個氨基酸殘基構(gòu)成的肽稱為寡肽(Oligopeptide)，而將僅由2個或3個氨基酸殘基構(gòu)成的二肽和三肽稱之為小肽(Small peptide)。(參考《動物營養(yǎng)學》第三版)

　　二、小肽含量的檢測方法：

　　1、大豆肽粉，國標：GB/T 22492-2008

　　原理：采用高效凝膠過濾色譜法測定。即以多孔性填料為固定相，依據(jù)樣品組分相對分子質(zhì)量大小的差別進行分離，在肽鍵的紫外吸收波長220nm條件下檢測，使用凝膠色譜法測定相對分子質(zhì)量分布的專用數(shù)據(jù)處理軟件(即GPC軟件)，對色譜圖及其數(shù)據(jù)進行處理，計算得到大豆肽的相對分子質(zhì)量大小及分布范圍。

　　本法適用于以大豆粕或大豆蛋白等為原料，用酶解或微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的，相對分子質(zhì)量在5000以下，主要成分為肽的粉末狀物質(zhì)。

　　2、海洋魚低聚肽粉，中國輕工行業(yè)標準：QB/T 2879-2007

　　2.1  低聚肽

　　方法原理：低分子量的蛋白質(zhì)水解物(包含低聚肽及游離氨基酸)可溶于三氯乙酸溶液;高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)在三氯乙酸溶液中易沉淀。樣品經(jīng)三氯乙酸溶液溶解后，離心分離出沉淀蛋白質(zhì)，收集離心清液。按照GB/T5009.5規(guī)定的方法測定離心清液的酸溶蛋白質(zhì)水解物含量，清液的酸溶蛋白質(zhì)水解物含量減去游離氨基酸含量即得到低聚肽的含量。

　　該法僅可以粗略測出樣品中的三氯乙酸可溶性氮，并且不能扣除核酸中的含氮堿基對檢測結(jié)果的干擾，更加不能精確檢測二肽、三肽具體含量是多少。

　　2.2  相對分子質(zhì)量小于1000u的蛋白質(zhì)水解物所占比例(高效凝膠過濾色譜法)

　　方法原理：相對分子質(zhì)量小于1000u的蛋白質(zhì)水解物(包括低聚肽和少量游離氨基酸)所占比例，采用高效凝膠過濾色譜法測定。即以多孔性填料為固定相，依據(jù)樣品組分分子體積大小的差別進行分離，在肽鍵的紫外吸收波長220nm條件下檢測，使用凝膠色譜測定相對分子質(zhì)量分布的專用數(shù)據(jù)處理軟件(即GPC軟件)，對色譜圖及其數(shù)據(jù)進行處理，計算得到蛋白質(zhì)水解物的相對分子質(zhì)量大小及分布范圍，進而得到相對分子質(zhì)量小于1000u的蛋白質(zhì)水解物(包括低聚肽和少量游離氨基酸)所占比例。

　　本法適用于以海洋魚皮、魚骨或魚肉為原料，用酶解法生產(chǎn)的，相對分子質(zhì)量低于1000的低聚肽(短肽)為主要成分的粉末。

　　三、蛋白質(zhì)的含量測定方法

　　蛋白質(zhì)的含量測定是生化藥品研究最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的測定方法有凱氏定氮法、福林酚法、雙縮脲法、BCA法、考馬斯亮藍法、紫外分光光度法及熒光法?！稓W洲藥典》6.0版、《英國藥典》2009年版及《美國藥典》32版附錄中均收載了上述七種方法，《中國藥典》2005年版三部附錄僅收載了上述測定方法中的前三種。以下僅供參考：

　　3.1 凱氏定氮法：

　　原理：本法系依據(jù)蛋白質(zhì)為含氮的有機化合物，當與硫酸和硫酸銅、硫酸鉀一同加熱消化時使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以氮轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。凱氏定氮法雖耗時較長，但它是蛋白質(zhì)測定方法中最經(jīng)典的測定方法，本法所測的結(jié)果為蛋白質(zhì)絕對濃度而非相對濃度，可用于標準蛋白質(zhì)含量的準確測定。

　　3.2  福林酚法：

　　原理：本法系依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與 Cu 2 + 螯合形成蛋白質(zhì)- 銅復合物，此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍色化合物，同時在堿性條件下酚試劑易被蛋白質(zhì)中酪氨酸、 色氨酸、 半胱氨酸還原呈藍色反應，在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對照品溶液作標準曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質(zhì)的含量。

　　3.3  雙縮脲法：

　　原理：本法系依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的兩個以上肽鍵在堿性溶液中與 Cu 2 + 形成紫紅色絡合物， 在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對照品溶液作標準曲線， 采用比色法測定供試品中蛋白質(zhì)的含量。

　　3.4  Bradford法(考馬斯亮藍法)：

　　原理：考馬斯亮藍(CBB)測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm;當它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)—色素結(jié)合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應十分迅速;其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質(zhì)含量，測定蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1 000μg/ml，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。

　　四、小結(jié):

　　小肽 (二肽、三肽)作為蛋白質(zhì)的主要消化產(chǎn)物，在氨基酸消化、吸收和代謝中起著重要作用。但酵母水解物與小麥水解蛋白、大豆肽粉等專屬的肽類蛋白原料不同，它還含有核酸、多糖等其他大分子(約30%以上)。而且小肽的含量與酶解所用的酶制劑、添加比例、酶解時間、溫度、pH值等均有一定的相關性，檢測時在樣品處理、國標、行業(yè)標準、實驗室常用檢測方法等方面，尚缺乏系統(tǒng)、精確、可重復性的檢測方法方面的公開報道。而且，酵母水解物作為一種強誘食性的蛋白原料，只有以新鮮酵母為原料，經(jīng)充分水解、干燥后才能呈現(xiàn)特有的鮮味，品控重點應以產(chǎn)品使用價值為目標，以《飼料原料目錄》中強制標識要求為根據(jù)。

　　因此，我們暫時不建議將小肽作為酵母水解物的常規(guī)指標加以評估，而應該將方便飼料企業(yè)檢測、且能反應出產(chǎn)品品質(zhì)的指標，如粗蛋白、氨基酸態(tài)氮、核酸、甘露聚糖、水分、灰分等作為常規(guī)品控指標。

　　以上觀點僅代表湖北海宜，不足之處還望同行及用戶多多包涵，并歡迎共同探討!