體外酶法研究進展

　　摘要：消化能值是評定飼料能量生物學(xué)效的主要指標之一?？陀^精準地評定飼料的消化能值是確定動物營養(yǎng)需要量及優(yōu)化飼料配方的主要決策依據(jù)。本文主要介紹了體外酶法的研究進展，影響評定準確性的因素以及體外酶法評定飼料消化能中存在的一些難題。

　　關(guān)鍵詞：豬;消化能;體外酶法

　　引言

　　能量是飼料營養(yǎng)物質(zhì)的第一要素。代謝能值是評定飼料能量生物學(xué)效的主要指標之一，因此，客觀精準地評定飼料的代謝能值是確定動物營養(yǎng)需要量及優(yōu)化飼料配方的主要決策依據(jù)。目前評定飼料營養(yǎng)價值的方法主要有體內(nèi)法、半體內(nèi)法(運動尼龍袋法)和體外法(酶法)。體內(nèi)法和半體內(nèi)法評定飼料營養(yǎng)物質(zhì)在小腸消化率雖然較為客觀實際，但都需要依賴于試驗動物，半體內(nèi)法還需要借助于必要的瘺管手術(shù)和試驗設(shè)備，試驗較麻煩且費用昂貴，不適于生產(chǎn)實際，而酶法是利用一種或多種酶或動物小腸液模擬動物體內(nèi)的環(huán)境，在體外對營養(yǎng)物質(zhì)進行消化，以評定營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，是一種快速且相對準確的試驗方法。

　　酶法最早產(chǎn)生于50年代，最初只是用單一胃蛋白酶法評定飼料蛋白質(zhì)的消化率，雖然這一方法快速簡便，但與體內(nèi)法所測數(shù)據(jù)相差較大(Grand 和Carroll,1958; Campbell,1961)。Akeson和Stahmann(1964)進一步發(fā)展了酶法，在胃蛋白酶的基礎(chǔ)上又加入了胰蛋白酶，測得真蛋白消化率與體內(nèi)法所測數(shù)據(jù)強烈相關(guān)(r=0.995)，使得胃蛋白酶加胰蛋白酶法成為評定單胃動物飼料蛋白質(zhì)消化率的常規(guī)方法, 但這種方法是在假定蛋白消化率不受其他養(yǎng)分消化影響的基礎(chǔ)上建立的，而消化道酶譜是一個復(fù)雜多變的多酶系統(tǒng)，由于各種酶元所需要的激活條件不同以及酶作用于底物的反饋抑制作用。所以胃蛋白酶加胰蛋白酶法并不能真正反映體內(nèi)消化過程。日本Furuya(1974)提出了胃蛋白酶加小腸液測定離體消化試驗方法，通過離體法和全收糞二者比較,兩法干物質(zhì)和能量消化率間均為強相關(guān)，且測值相當(dāng)一致。國內(nèi)張子儀等(1981-1988)對此法做了進一步研究，已形成一套完整的實驗室測定豬飼料營養(yǎng)物質(zhì)消化率的體外方法。

　　國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析

　　自Kuhn (1894)首創(chuàng)用能量直接衡量飼料營養(yǎng)以來，飼料有效能值的評定已經(jīng)歷了一個多世紀。豬消化能值的研究也是伴隨著研究方法的改進而不斷發(fā)展，飼養(yǎng)試驗和代謝試驗等生物學(xué)法是評定飼料有效能值較為科學(xué)、合理的一種試驗方法，但這些方法往往耗時、費力，很難在短時間內(nèi)對大量的飼料樣品進行評價、分析且不宜標準化。因此，有必要尋求一種快速、準確、簡便、經(jīng)濟的評定方法。長期以來，各國營養(yǎng)學(xué)家試圖通過酶水解法建立一種快速測定飼料能量生物學(xué)效價的方法，但這種方法一直處于實驗室階段而未應(yīng)用于生產(chǎn)，其主要原因就在于未解決方法的標準化問題，實質(zhì)上是消化酶的標準化問題，即酶的活性和種類。眾所周知，飼料主要在豬的小腸中消化，而豬的胰腺及腸道內(nèi)的消化酶活性并非怛定的，若以胰腺或小腸液作為酶法的消化酶來源，則因消化酶活性的變異較大而無法解決標準化問題，因此，根據(jù)豬小腸的酶解特性來建立與之等效的模擬腸液及仿生消化方法將為豬飼料代謝能值的酶法定量測定技術(shù)解決重大技術(shù)難題，對提高我國豬的生產(chǎn)水平，節(jié)約飼料資源以及減少排泄物對環(huán)境的污染有重要的社會和經(jīng)濟效益。

　　1酶法評定方法

　　隨著20世紀30年代胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶結(jié)晶的析出及隨后的各種消化酶測定方法的發(fā)展，許多學(xué)者將離體消化的模擬模型定格到了由一種或兒種關(guān)鍵酶分步降解的離體反應(yīng)模型，并進行了一系列研究，提出了一步酶解法與多步酶解法(張鐵鷹，2002)。

　　1.1一步酶解法

　　一步酶解法主要是根據(jù)蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下肽鍵斷裂，由蛋白質(zhì)的水解程度來判斷蛋白質(zhì)品質(zhì)及其在體內(nèi)的消化率(Sheffner等1956; Taverner和Farrell， 1981; Hewitt等1985; Meer等1990)或由解離出的氫離子導(dǎo)致溶液pH值降低的幅度和蛋白質(zhì)體內(nèi)消化率之間建立回歸方程，預(yù)測體內(nèi)蛋白質(zhì)的消化率( Maga等, 1973; Hsu等, 1977 )，但預(yù)測的精確度可能會受到多種因素的影響，特別是飼料樣品中礦物質(zhì)緩沖能力的影響。為此，Pedersen和Eggum等(1983)對其進行了改進，即用NaOH不斷中和蛋白質(zhì)水解過程產(chǎn)生的氫離子，使PH值保持不變。此方法雖然簡單、快速，但考慮的因素較單一。由于抗?fàn)I養(yǎng)因子、熱處理及飼料物理性狀的影響，測定結(jié)果與生物學(xué)法的相關(guān)性很低，且僅限于對飼料蛋白質(zhì)消化率進行評價和預(yù)測，不適合對其它營養(yǎng)成分進行評定。

　　1.2多步酶解法

　　飼料養(yǎng)分在動物體內(nèi)的消化過程是由物理消化與多種消化酶共同參與下完成的，只有充分考慮養(yǎng)分在體內(nèi)消化的各種關(guān)鍵因素，不斷改進對消化道內(nèi)各種環(huán)境條件的模擬，才能使預(yù)測結(jié)果更科學(xué)。隨著畜禽消化生理學(xué)及酶學(xué)的發(fā)展，單胃動物體外消化模擬技術(shù)也得到了發(fā)展，已由過去的單一酶法發(fā)展為現(xiàn)在的多酶法。多酶法不但對胃消化過程進行模擬，而且還對胰腺分泌消化酶、小腸消化以及大腸微生物消化等過程進行模擬，即由兒種消化酶同時完成畜禽體內(nèi)消化過程。根據(jù)后段消化道模擬部位的不同，多酶法可簡單分為胃-小腸兩步法和胃-小腸-大腸三步法。

　　1.2.1胃-小腸兩步法

　　Buchmann等(1979)使用胃蛋白酶一胰酶來預(yù)測蛋白質(zhì)的體內(nèi)消化率，利用該方法所測定30種大麥蛋白體外消化率與大鼠體內(nèi)消化率存在很強的相關(guān)性。其后，Boisen等(1991) , Boisen和Fernandez等(1995)主要針對此方法中降解物與未降解物的分離方法進行了研究并提出了修改方案。修訂后的方案所測飼料干物質(zhì)、有機物、蛋白質(zhì)、能量的消化率與生物學(xué)法均存在強相關(guān)關(guān)系。但此方法中，消化產(chǎn)物不斷積累會對酶促反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，從而導(dǎo)致體外養(yǎng)分消化率降低，影響其預(yù)測體內(nèi)養(yǎng)分消化率的準確性。此外，此方法中用三氯乙酸或磺基水楊酸溶液來沉淀反應(yīng)液中未被降解但溶于水的蛋白質(zhì)，然而淀粉和脂肪的消化產(chǎn)物并不能簡單地以三氯乙酸或磺基水楊酸來分離。同時，一些可以被動物吸收的小肽也被人為的劃分為未被消化蛋白。為此，一些學(xué)者為了克服消化產(chǎn)物累積對酶促反應(yīng)的抑制作用，建立了以透析為手段去除消化產(chǎn)物的方法并對消化酶的濃度、飼料粒度、透析時間、透析袋截留分子量大小、透析液流速及酶促反應(yīng)溫度等因素進行了一些研究，得出透析法與生物學(xué)法的相關(guān)性比未去除產(chǎn)物法更高的結(jié)論，并提出了幾套體外消化模擬操作規(guī)程(Cave等> 1988;Gauthier等，1982; Savoie和Gauthier, 1986; Drake,1991;黃瑞林等，1999;張鐵鷹等，2002)。

　　這些方法所采用的透析袋截留分子量為1OOODa, 恰好能夠使氨基酸和部分小肽通過，這與蛋白質(zhì)在體內(nèi)的實際吸收情況比較接近。因此，其在預(yù)測蛋白質(zhì)的體內(nèi)消化率上比未去除產(chǎn)物方法更合理。然而透析袋的孔徑主要針對蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物，并不能改善對飼料有效能及其它養(yǎng)分消化率的預(yù)測值。畜禽采食的飼料經(jīng)過胃初步消化后，通過胃運動分批轉(zhuǎn)運到下一段消化道(十二指腸)。因此，如果利用豬小腸液測定飼料體外消化率，除胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等主要消化酶外，胰臟分泌的微量物質(zhì)、肝臟分泌物及腸肽酶等一些影響?zhàn)B分消化的成分均可通過豬小腸液來獲得。這樣可以使體外消化模擬過程與體內(nèi)更接近，所測定結(jié)果也更可靠合理。中國農(nóng)科院畜牧研究所在20世紀80年代對該方法進行了系統(tǒng)的研究和改進，建立了一套標準化的操作程序，利用該方法測定的飼料干物質(zhì)和能量體外消化率與生物學(xué)法間存在強相關(guān)(R2=0.95 0.98).

　　1.2.3胃-小腸-大腸三步法

　　一步及兩步酶解法主要模擬了胃或胃與小腸的消化，并沒有考慮回腸以后微生物的作用，而豬后段消化道微生物發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸所提供的能量大約占日糧中提供能量的12%(Kass 等, 1980)。以這些方法來預(yù)測養(yǎng)分的表觀消化率及有效能時存在一定的局限。Fonty和Goue(1989)及Ahrens等(1991)發(fā)現(xiàn)，瘤胃微生物與豬大腸內(nèi)微生物的組成和發(fā)酵原理存在許多共同之處，為此，一些學(xué)者提出了胃蛋白酶一胰酶一瘤胃液(Fonty和Gouet, 1989)及胃蛋白酶一胰酶一碳水化合物酶三步酶解法，并建立了操作規(guī)程(Metz和VanderMeer, 1985; Boisen和Fernandez, 1994,1997)。瘤胃液法與碳水化合物酶法相比消化處理所用時間長，受瘤胃液的來源影響較大;而碳水化合物酶是一種商品，組分穩(wěn)定，而且消化處理所用時間也較短。Boisen和Fernandez(1997)利用碳水化合物酶法測定的90個飼料樣品和31種配合飼料的體外有機物質(zhì)消化率與體內(nèi)能量消化率之間存在線性相關(guān)(RZ=0.94)，這表明利用胃蛋白酶一胰酶一碳水化合物酶三步酶解法能夠較好地預(yù)測單胃動物飼料的消化能。

　　2影響酶法評定效果的因素

　　2.1動物品種及小腸部位的影響

　　陳雪秀等(1984)研究了用不同品種豬(杜北、長楓、北京黑)小腸液測得離體消化率

　　的比較，結(jié)果表明，北京黑豬的小腸液的淀粉酶和胰蛋白酶活均高于杜北，用杜北豬小腸液測出的離體干物質(zhì)消化率及能量消化率在測定低蛋白日糧時與長楓、北京黑豬無差異，應(yīng)用杜北豬小腸液測定高蛋白日糧時其離體能量消化率比北京黑豬小腸液的測值低(P<0.05)。

　　研究表明小腸液的酶活與小腸的部位有關(guān)，(Toofanian等，1973;iddons,1968;Russell等，1981)，因而從小腸不同部位采集的小腸液酶活不同，所測得的營養(yǎng)物質(zhì)離體消化率可能不同。Keys等(1974)報道，飼料中的養(yǎng)分在小腸各部位的消化率有很大差異，在小腸上部的有機表觀消化率為29.8%，而在小腸中下部達65.9%。陳雪秀等(1984)研究表明，用距幽門50cm處采集的豬前瘺小腸液處理的離體消化率與常法相差較大，如干物質(zhì)消化率比常法低4.7%-5.1%，能量消化率低6.5-8%，而用距幽門170cm處采集的后瘺小腸液的測值與常法相近。

　　2.2不同日糧營養(yǎng)水平對小腸液的影響

　　動物日糧水平影響小腸消化酶的活性(Clary等，1969;Van Hellen等1978; Russell等1981;Jahnson等1977; Owens等，1986)。因而用來源于不同日糧類型的小腸液測得的離體消化率可能存在差異。Karrel等(1966)和Owens等(1986)報道，淀粉酶的活性是影響淀粉在小腸消化率的因素之一。王述容等(1981)報道，在采集豬小腸液前連續(xù)十天喂給單一飼料-麩皮，然后采集腸液，用此腸液與混合料腸液處理的離體消化率比較，混合料處理的離體干物質(zhì)消化率比單喂麩皮處理的高7-10%，但蛋白和能量的消化率相差不大。而姜云俠等(1983)研究表明，飼喂不同營養(yǎng)水平日糧(高能量低蛋白日糧和低能量高蛋白日糧)的豬小腸液對離體干物質(zhì)消化率、粗蛋白質(zhì)消化率無顯著影響。

　　2.3環(huán)境PH及Ca2+的影響

　　梁皓儀等(1988)報道，豬小腸液凍干粉(PIF )對粗蛋白質(zhì)的消化率受pH的影響較小，當(dāng)pH在7.0-8.5范圍內(nèi)，PIF對蛋白質(zhì)的消化率無大的差異。

　　2.4小腸液凍干粉的用量與離體消化率的關(guān)系

　　張建中(1997)研究了牛小腸液凍干粉(BIF)的用量對淀粉消化率的影響，研究表明，當(dāng)BIF用量為0.3克時//0.5克飼料(BIF中淀粉酶的活性為302.18IU/g)，淀粉的消化率趨于穩(wěn)定，再增加BIF用量，其淀粉消化率變化不大。李建國(1997)就BIF用量對瘤胃非降解蛋白(UDP)消化率的影響進行了研究，結(jié)果當(dāng)小腸液凍干粉用量在12單位//0.5克UDP以上時，UDP的消化率基本穩(wěn)定，因此，在用小腸液凍干粉測定營養(yǎng)物質(zhì)的消化率時應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)挠迷氯椤?/p>

　　2.5培養(yǎng)時間對離體消化率的影響

　　梁皓儀等(1988)分別測定了三種豬日糧經(jīng)胃蛋白酶一PIF消化3小時和4小時后的粗蛋白消化率，結(jié)果表明，不同培養(yǎng)時間對樣品粗蛋白的消化率沒有影響。王忠生(1994)用胃蛋白酶和BIF結(jié)合評定UDP消化率的試驗結(jié)果為，當(dāng)把胃蛋白酶的處理時間固定在4小時，延長BIF的培養(yǎng)時間，飼料UDP消化率有增長趨式，但培養(yǎng)時間超過6小時，增長出現(xiàn)停滯現(xiàn)象。張建中(1997)就BIF對淀粉、熟淀粉及瘤胃24小時玉米殘渣的離體消化試驗表明，對于淀粉和熟淀粉，BIF的培養(yǎng)時間從6小時開始穩(wěn)定，6小時后各時間點的消化率無顯著差異(P>0.05)，玉米和瘤胃24小時玉米殘渣的淀粉消化率從7小時后穩(wěn)定，7小時后各時間點的淀粉消化率差異不顯著(P>0.05)，通過以上研究結(jié)果可看出，用小腸液凍干粉做離體消化試驗時，應(yīng)根據(jù)不同的飼料選擇不同的培養(yǎng)時間。

　　2.6小腸液凍干粉不同加工條件及不同保存條件對離體消化率的影響

　　張蔚云等(1984-1985)對不同加工工藝及不同保存條件下的PIF的胰蛋白酶活，離體干物質(zhì)消化率，離體能量消化率進行了效價檢驗，結(jié)果表明，不同加工和保存條件下(小腸液一次解凍與二次解凍;凍干后的PIF抽真空保存與不抽真空保存：抽真空保存的PIF分別貯存于室溫和0℃冰箱中)，PIF的胰蛋白酶活性基本上無顯著變化((P>0.05);在加工前的PIF原料不論是二次解凍還是一次解凍，貯存時無論抽真空還是不抽真空，只要保存在25℃以下，至少可保持3個月效價穩(wěn)定不變。但當(dāng)溫度超過25℃時，PIF凍干粉效價有下降趨勢。

　　3，目前存在的難題

　　離體評定方法從操作的簡便性和模擬結(jié)果的科學(xué)合理性方面均有很大發(fā)展，但仍然存在許多不足之處。首先，消化模型中各項消化參數(shù)只是部分與體內(nèi)實際情況相吻合，而有些參數(shù)則相差較遠，需要繼續(xù)完善和發(fā)展。其次，多數(shù)消化模型沒有考慮到日齡對動物體內(nèi)能量消化率的影響，不能對飼料能量在不同生長階段的畜禽體內(nèi)的消化率進行準確預(yù)測，尤其是仔豬等生長速度較快的動物。由此可見，用離體法預(yù)測飼料有效能值方法的研究仍任重道遠。